Laboratorium Genomowe

Laboratorium Genomowe oferuje sekwencjonowanie następnej generacji na dwóch platformach Illuminowych – MiSeq i HiSeq. Ponadto świadczy usługi przygotowania bibliotek na systemie Access Array (Fluidigm) i przeprowadzenia reakcji emulsyjnego PCR.

Kontakt:
tel 512 837 688
e-mail: ngs@cbdna.pl

Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS – next generation sequencing) polega na jednoczesnym sekwencjonowaniu przez syntezę klonalnie powielonych lub pojedynczych cząsteczek DNA na jednym mikrochip’ie (flow cell). Sekwencjonowanie NGS odbywa się poprzez iteracyjne cykle wydłużania przez polimerazę łańcucha matrycowego DNA i następnie odcięcia znakowanego terminatora. W każdym cyklu przyłączane są cztery nukleotydy, z których każdy jest znakowanym innym kolorem terminatora (każdy cykl – wydłużenie łańcucha o 1 zasadę)

Technologia sekwencjonowania następnej generacji (NGS) pozwala na precyzyjny odczyt sekwencji z dokładnością wyższą niż 99.9% dla pojedynczej zasady, nie osiągalny dla żadnej innej metody laboratoryjnej, dając wgląd w informację genetyczną w postaci genomów, transkrytpomów, czy epigenomów dowolnych organizmów.

Zastosowanie platformy NGS firmy Illumina: MiSeq i HiSeq.

Pracownia oferuje kompleksowe usługi sekwencjonowania genomowego w technologii NGS, począwszy od izolacji materiału (z tkanek, osadu leukocytarnego, krwi, wymazu), przez oczyszczanie, oznaczenie ilościowe metodą fluorymetryczną (Qubit), przygotowanie bibliotek, po sekwencjonowanie i analizę bioinformatyczną.

  • Analiza genomu (Sekwencjonowanie całogenomowe, Sekwencjonowanie de novo, Sekwencjonowanie de novo małych genomów (bakterie, drożdże, wirusy) lub plazmidów, Sekwencjonowanie typu Mate Pair, Sekwencjonowanie exomów, Resekwencjonowanie celowane, Sekwencjonowanie amplikonów,
  • Analiza transkryptomu (Sekwencjonowanie RNA – RNAseq, Sekwencjonowanie miRNA)
  • Analiza epigenomu (Analiza interakcji DNA-białko (Chip-Seq), Analiza metylacji)
  • Mikromacierze ekspresyjne
  • Metagenomika (16S)
  • Panele genetyczne:
  • Panele nowotworowe + mutacje germinalne (predyspozycje genetyczne

Adres email na który można kierować pytania na temat NGS: ngs@cbdna.pl

Sekwencjonowanie de novo

Unikalne połączenie długości odczytów i ich głębokości, jak również możliwość sparowanego sekwencjonowania różnej długości insertów czyni platformę MiSeq idealną do sekwencjonowania de novo małych genomów. Dokładność odczytów surowych danych wygenerowanych przez system umożliwia umiejętne i efektywne tworzenie wysokiej jakości kontigów i identyfikację wariantów o znaczeniu biologicznym.

Sekwencjonowanie amplikonów

Niewątpliwą zaletą platformy MiSeq jest możliwość sekwencjonowania amplikonów. W przeciwieństwie do tradycyjnej metody sekwencjonowania Sangera, dającej maksymalnie 2-krotne pokrycie (coverage), sekwencjonowanie NGS umożliwia otrzymanie pokrycia nawet rzędu kilkuset tysięcy w zależności od złożoności i potrzeb projektu. Standardowo przyjmowany jest coverage rzędu 20-30x, co oznacza, że dana zasada w DNA zostanie odczytana 20-30 razy.

Metagenomika (16S RNA)

Metagenomika dąży do określenia liczebności i rodzaju mikroorganizmów w próbie. Badania metagenomowe są powszechnie używane do analizy prokariotycznego genu 16S rRNA, mającego długość ok. 1 500 pz, zawierającego dziewięć przeplatanych konserwatywnych i zmiennych regionów, co ułatwia sekwencjonowanie i filogenetyczną klasyfikację dowolnego gatunku mikroorganizmu ze złożonej populacji mikroorganizmów. System MiSeq stanowi najbardziej kompleksowe i efektywne kosztowo rozwiązanie dla wszystkich badań metagenomowych. Pozwala na określenie niemal kompletnego genomu z poszczególnych mikroorganizmów bezpośrednio z próbek środowiskowych, czy próbek klinicznych bez konieczności hodowli w warunkach laboratoryjnych.

Sekwencjonowanie small RNA

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe miRNA ma fundamentalne znaczenie dla zrozumienia ekspresji genów. Określenie profilu miRNA regulujących ekspresję innych genów poprzez inhibicję translacji mRNA i/lub indukcję degradacji mRNA ma coraz większe znaczenie w biologii molekularnej. Wykazano, że miRNA są kluczowymi regulatorami w licznych procesach biologicznych, w tym: rozwoju, różnicowaniu, apoptozie i proliferacji. Ponadto, profile miRNA są w coraz większym stopniu uznawane za biomarkery, w szczególności w dziedzinie badań nad nowotworami, co sugeruje że mogą odgrywać rolę jako nowa klasa onkogenów lub supresorów nowotworów. Zastosowanie sekwencjonowania następnej generacji z wykorzystaniem platform firmy Illumina stwarza więc perspektywy na odkrycie profili molekularnych związanych np. z danym stanem chorobowym.

Sekwencjonowanie RNA (RNA-seq)

Dzięki swojej szybkości, wydajności i dokładności, sekwenatory NGS oferują nową opcję dla klasycznego sekwencjonowania RNA i analizy transkryptomu. Metoda RNA-seq jest alternatywą dla mikromacierzy ekspresyjnych. Ponadto, miliony odczytów powstałe podczas sekwencjonowania RNA mogą być przyrównane do miejsc splicing’owych umożliwiając identyfikację izoform RNA, odkrycie nowych transkryptów, genów fuzyjnych, a także niekodujących RNA. Analiza może być wykonana dla każdego gatunku dla którego istnieje genom referencyjny. Ponadto dane ekspresyjne otrzymane z sekwenatora NGS mogą być poddane analizie z wykorzystaniem wielu tych samych narzędzi powszechnie stosowanych w analizach mikromacierzowych, w tym klastrowaniu hierarchicznym.

Panele nowotworowe

  • rak jelita grubego
  • rak piersi
  • rak prostaty
  • rak płuc
  • rak trzustki
  • rak tarczycy
  • rak żołądka.

Cel:
A) określanie predyspozycji genetycznych – analiza genów biorących udział w rozwoju indywidualnych predyspozycji do rozwoju nowotworu;
B) terapie celowane w leczenie nowotworów – sekwencjonowanie genów związanych z odpowiedzią organizmu na leki

System Access Array™ (Fluidigm) to pierwszy wysokoprzepustowy system wzbogacania próbek zaprojektowany do pracy ze wszystkimi najpopularniejszymi systemami sekwencjonowania następnej generacji, w tym MiSeq. System Access Array umożliwia wzbogacanie próbek oraz znakowanie ich do sekwencjonowania multiplexowego, a także przygotowanie bibliotek poprzez tagowanie amplikonów. Tagowanie amplikonów przy użyciu systemu Access Array znacząco redukuje czas potrzebny do otrzymania sekwencji docelowych łącząc w sobie tworzenie amplikonów z przygotowaniem bibliotek. Jest to kompletne rozwiązanie do badań wymagających niskiego kosztu i szerokiego spektrum przepustowości. Umożliwia jednoczesną analizę 48 prób na 48 amplikonów (48×48), co łącznie daje 2304 reakcji. System stwarza również możliwość multipleksowania – w efekcie otrzymując aż do 480 amplikonów na próbę.

Zastosowanie:

  • analiza SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
  • analiza CNV (Copy Number Variation)
  • detekcja mutacji
  • analiza metylacji
  • analiza meta genomowa
  • analiza pojedynczych komórek

PCR emulsyjny jest nowym podejściem w biologii molekularnej służącym do wykrywania kwasów nukleinowych i oceny ilościowej produktu. ddPCR oferuje odmienny sposób absolutnej kwantyfikacji i detekcji rzadkich alleli w stosunku do konwencjonalnej metody PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR, qPCR). Metoda ddPCR oparta jest o emulsyjno-kropelkową technologię, dzięki czemu pojedyncza próbka ulega w czasie rzeczywistym frakcjonowaniu na 20 000 kropli umożliwiając czułą i precyzyjną detekcję obecności w każdej z nich nawet pojedynczej cząsteczki DNA. System sczytuje cząsteczki docelowe (dodatnie) i wszystkie pozostałe (negatywne), w oparciu o które generuje się bezwzględna liczba cząsteczek docelowych w próbce, bez konieczności odniesienia do krzywych standardowych czy genu referencyjnego (w przeciwieństwie do qPCR). Sprawia to, że ddPCR jest znacznie czulszą alternatywą dla klasycznej reakcji qPCR.

Zastosowanie ddPCR

  • detekcja rzadkich mutacji
  • absolutna kwantyfikacja ekspresji genów, analiza miRNA
  • absolutna kwantyfikacja miana wirusa, detekcja patogenów, analiza pojedynczych komórek
  • detekcja rzadkich sekwencji
  • absolutna kwantyfikacja bibliotek do sekwencjonowania NGS
  • analiza CNV (Copy Number Variations)

Zalety PCR emulsyjnego:

  • brak konieczności odniesienia do krzywych standardowych, czy genu referencyjnego
  • zwiększona precyzja może być osiągnięta poprzez zwiększenie liczby powtórzeń
  • wysoka tolerancja na inhibitory
  • zdolność analizy złożonych mieszanin
  • wyniki są generowane w postaci liniowej w zależności od liczby obecnych kopii, co ułatwia analizę małych różnic w zmianie fold’u (fold change)

W naszej ofercie znajduje się szeroki wachlarz usług bioinformatycznych, pozwalający na kompleksową i wielopoziomową analizę dostarczonych danych.

Oferujemy między innymi:

  • Analizy danych otrzymanych za pomocą metod sekwencjonowania następnej generacji (NGS, ang. Next Generation Sequencing), m.in: RNA-seq, smallRNA-seq, analiza metylacji, analiza sekwencjonowania amplikonów, plasmidów, de novo, analizy mikromacierzowe, metagenomowe, paneli genetycznych itp.
  • Analizy sekwencji DNA i białek
  • Analizy filogenetyczne
  • Modelowanie molekularne
  • Analizy interakcji białko-ligand
  • Wirtualną analizę przesiewową (VS, ang. Virtual Screening)
  • Analizy powiązania sekwencji, struktury i funkcji białek
  • Projektowanie i wykonanie niestandardowych analiz danych biologicznych, dostosowanych do potrzeb konkretnych danych/badań
  • Pomoc w interpretacji wyników analiz bioinformatycznych dostarczonych przez Klienta.